前言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。
本标准起草单位：辽宁省动物动物卫生监测预警中心、锦州医科大学、海城市动物卫生监督所等单位。
本标准主要起草人：刘全、李宁、王立成、赵刚、张婷婷、韩硕、张娜、夏伟、祝琳琳、张林、余淼、张旭、章春燕、张建平、马强、高静荐、李桂娟。
犬冠状病毒病诊断技术规范
范围
本标准规定了犬冠状病毒病诊断的技术方法、步骤和结果判断依据。
本标准适用于我省境内的犬饲养场（户）、动物诊疗单位和动物疫病预防控制部门对犬冠状病毒病的诊断。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版本）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
犬冠状病毒 Canine coronavirus，CCV
属于冠状病毒科冠状病毒属，呈圆形或椭圆形，有囊膜，囊膜表面有纤突，病毒核酸为单股RNA病毒。
犬冠状病毒病 Canine coronavirus disease
是由犬冠状病毒引起的以急性胃肠炎为主要特征的一种高度接触性传染病。
CCV胶体金检测试纸
以胶体金作为示踪标志物，用于检测样品中犬冠状病毒的检测试纸。
CRT Capillary filling test
毛细血管充盈实验。
诊断
本病通过犬冠状病毒病的流行病学特征、临床症状和剖检病理变化建立临床诊断标准；应用现代免疫学（CCV胶体金检测试纸）和分子生物学（RT-PCR病毒基因检测）技术，建立实验室快速诊断方法。
流行病学诊断
病犬和带毒犬是主要传染源，病犬和带毒犬粪便中含有大量CCV，通过污染的饲料、饮水、笼具和周围环境直接或间接地传染给易感犬；
各种年龄、品种和性别的犬均易感，但以2～4月龄犬发病率最高，出生后2～3天的幼犬常迅速成窝死亡，发病率几乎100%， HYPERLINK "/doc/5853718-6066559.html" \t "/doc/_blank" 病死率可达50%左右；
本病一年四季均可发生，但冬季多发；该病的发生和严重程度常与断乳、运输、气温骤变、饲养管理条件恶化以及年龄、应激或其他病原混合感染等因素有关。
临床症状诊断
潜伏期：CCV 感染潜伏期较短，一般为 1～3 天。
病程：病程一般为7～10天。
精神状态：病初精神沉郁、厌食、贪睡，后期衰弱昏迷。
呕吐：发病12小时后出现呕吐，每日呕吐几次至十多次不等，呕吐物初为胃内容物，后为混有泡沫的黄绿色黏液。
腹泻：呕吐的同时，出现腹泻，粪便由糊状、半糊状变至水样，其颜色由暗绿色或灰绿色逐渐变成酱油色，便中含黏液、大量血液及电解质等，粪便具恶臭味，出现血便的同时，病犬产生剧烈腹痛，两前肢触地，低头拱背而坐的姿势，后期，肛门括约肌松弛，排粪失禁，血水样粪便从肛门内流出。
体温变化：多数无体温变化，或仅出现低热。
血常规检查：白细胞计数大多正常或偏低，也有少数升高者，时有淋巴细胞增高或出现变异型淋巴细胞。
全身变化：发病后期，病犬眼球深陷，CRT时间延长，呼吸浅表，脉搏细弱而快，并出现严重的脱水和酸中毒症状。
其它： 幼犬要比成年犬的症状严重，幼犬迅速脱水，体重减轻，发病率和病死率较高，成年犬出现一过性腹泻后很快又恢复正常，一般不出现死亡。
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病理学诊断
病理剖检变化：患犬尸体严重脱水、肠壁菲薄、肠管扩张，肠粘膜充血、出血，肠内充满稀薄、水样、黄绿色内容物，胃粘膜脱落出血，胃内有粘液，仔犬胃中常有凝乳出现，肠系膜淋巴结肿大，病犬易发生肠套叠。
组织学变化：表现为小肠绒毛萎缩变短并融合，粘膜固有层细胞成份增多，隐窝加深，上皮细胞扁平，呈短柱状，杯状细胞排空。
应用现代免疫学（CCV胶体金检测试纸）诊断
测试步骤：
用棉签取适量新鲜粪便；将棉签浸入样品稀释管，充分搅拌混匀后，静置。
用一次性滴管取上清液作为检测液（样品若不能立即检测，应冷藏保存，超过24小时的，应冷冻保存，样品再次检测前需恢复至室温）。
将未开封的试纸卡和检测样品恢复至室温；将试纸卡水平放置，用滴管向试纸卡孔缓慢逐滴加入4滴不含气泡的检测液。
静止5分钟判断结果，10分钟后的结果仅作参考。
结果判断：
阳性：C线显示红色色带，T线也显示红色色带，无论颜色深浅均判为阳性。
阴性：C线显示红色色带，T线不显示红色色带，判为阴性。
无效：C线不显示红色色带，无论T线是否显示红色色带，该试纸均判为无效。
CCV胶体金检测试纸
分子生物学技术（RT-PCR病毒基因检测）
检测试剂和仪器
本规范中使用的试剂，除另有说明外，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装，水为符合GB/T 6682标准的灭菌双蒸水或超纯水。
本规范中应用的试剂和材料：Trizol（RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4℃～8℃保存）、氯仿（4℃预冷）、异丙醇（4℃预冷）、75%乙醇（用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，－20℃预冷）、DEPC水（1000mL双蒸水中加入1mL DEPC，室温下持续搅拌过夜，121℃高压灭菌25min）、RNA酶抑制剂（40 U/μL）、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP(2.5 mmol/L)、AMV反转录酶（5 U/μL）、三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液、溴化乙锭、DL2000 DNA Marker。
本规范中使用的设备：PCR扩增仪，高速冷冻离心机，核酸电泳仪和水平电泳槽，组织均浆机或研钵，凝胶成像系统、微量移液器。
病料采集与处理： 按照NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行。
实质脏器类：肝脾等研磨至浆糊状，加5倍体积的灭菌生理盐水稀释，3000r/min，离心10分钟，取上清液保存于-20℃待检。
肠内容物：粪样用0.01mol/L PBS做10倍稀释，12000r/min，离心5分钟，取上清液保存于-20℃待检。
引物设计合成：根据CCV M基因的核苷酸序列设计。
上游引物：5’-TCCAGATATGTAATGTTCGG-3’
下游引物：5’- TCTGTTGAGTAATCACCAGCT-3’
预期扩增片段大小约为409bp。
RNA的提取及cDNA的合成:：按照Trizol提取试剂说明书提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行转录合成cDNA，-20℃保存待检，并以其为模板进行CCV的PCR检测。
PCR反应体系：模板cDNA2.5μL，2×permix25μL，上、下游引物各1μL（10μmol/L），ddH2O 20.5μL。
反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30 sec，55℃退火1 min，72℃延伸30 sec，32个循环；72℃延伸5 min。反应结束后，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到大小片段在409bp的DNA片段。PCR电泳产物于4℃保存。
结果：
被检样品电泳出现409bp扩增带为犬CCV阳性，详见图2。
犬CCV阳性毒株PCR电泳图
注：M, DNA分子量标准（DL2000 Marker）；1样品检测；2犬CCV阳性对照；3,阴性对照。
结果判定
疑似犬冠状病毒病
符合犬冠状病毒病流行病学特点、临床症状或病理变化及CCV胶体金检测试纸阳性。
确诊犬冠状病毒病
被检犬符合结果判定5.1，且符合4.5分子生物学技术（RT-PCR病毒基因检测）的，确诊为犬冠状病毒病。
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