李余润 王馨 杨丽英 杨斌 宁玲 董志渊
摘 要：原生质体是进行单细胞测序和基因编辑研究的理想材料。为了研究不同酶解时间对灯盏花原生质体分离的影响，采用纤维素酶1%+果胶酶0.3%+半纤维素酶0.5%酶液处理愈伤组织悬浮细胞2，3，4，5，6 h，纤维素酶0.5%+果胶酶0.2%+离析酶0.5%酶液处理幼叶4，6，8，10，12，14，16 h。结果表明，不同酶解时间，灯盏花悬浮细胞和幼叶的原生质体产量及活力均差异显著。悬浮细胞酶解5 h，原生质体的产量和活力达到最高，分别为3.73×105个·g-1 、75.84%;幼叶酶解12 h，原生质体产量最高，达到1.17×106个·g-1，酶解10 h，原生质体活力最高，为80.98%。叶片的原生质体产量和活力明显高于悬浮细胞。
关键词：灯盏花;原生质体;酶解时间;产量;活力
中图分类号：S567.2 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.06.004
Abstract：
Protoplast is an ideal material for single-cell sequencing and gene editing. In order to optimize enzymatic hydrolysis times for the protoplast isolation of Erigeron breviscapus， suspension cells were incubated in an enzyme solution containing 1% cellulase， 0.3% pectinase and 0.5% hemicellulase for the 2，3，4，5，6 h and young leaves were incubated in an enzyme solution containing 0.5% cellulase， 0.2% pectinase and 0.5% macerozyme for the 4，6，8，10，12，14，16 h. The results showed enzymatic hydrolysis times significantly affect protoplast yield and viability. Five-hour enzyme incubation produced the maximum yield （3.73×105 protoplasts·g-1） and viability（75.84%） of protoplasts from suspension cells. Using young leaves as materials， the maximum yield（1.17×106 protoplasts·g-1） of the protoplasts was obtained at 12 h and the maximum viability（80.98%） was obtained at 10 h. The yield and viability of protoplasts from young leaves were both higher than those from suspension cells.
Key words：
Erigeron breviscapus; protoplast; enzymatic hydrolysis time; yield; viability
燈盏花（Erigeron breviscapus）为菊科飞蓬属多年生草本植物，全草入药，具有祛风散寒、活血通络止痛等功效[1]。药理研究表明，灯盏花含有黄酮、咖啡酸酯、挥发油等有效成分，具有神经保护、心脑血管保护、抗氧化、抗癌以及抗炎等药理作用[2]。以灯盏花为主要原料，已生产出灯盏花素片、灯盏细辛胶囊、灯盏细辛注射液以及灯盏花素注射液等药品[3]。
灯盏花原料种植中，主要采用种子进行育苗[4]。异花授粉、自交不亲和的繁育特性造成种植群体遗传变异大，有效成分的不稳定[5-7]。生产中，急需一种高效的单株无性快繁技术，培育基因型一致、遗传稳定的种苗。目前，以灯盏花叶片为外植体，初步建立了愈伤组织诱导、不定芽分化增殖及壮苗生根的快繁体系，但不定芽诱导系数较低[8-9]。关于愈伤组织离体再生形成不定芽的机制仍不清楚。因此，有必要分离叶片及其愈伤组织细胞，进行不同类型细胞脱分化、再生能力差异研究，为提高植株再生效率、优化无性快繁技术提供理论依据。
植物原生质体是指脱去细胞壁，由质膜所包围的具有生活力的细胞。由于没有细胞壁的阻碍，原生质体更容易从外界摄入DNA，更容易进行蛋白亚细胞定位[10-11]、基因编辑[12-13]等方面研究;同时，原生质体呈游离状态，为单细胞测序研究，从单细胞水平分析植物发育的分子机制提供了可能[14]。目前，关于灯盏花原生质体的研究未见报道。
酶解是分离植物原生质体的主要方法。纤维素酶、半纤维素酶降解细胞壁中的纤维素、半纤维素，果胶酶降解连接细胞的中胶层。本研究以愈伤悬浮细胞、离体植株幼嫩叶片为材料，采用酶解法，分离制备灯盏花原生质体，试验比较酶解时间对原生质体产量、活力的影响，为下一阶段开展细胞异质性、离体再生机制研究奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
灯盏花（Erigeron breviscapus）植株取自云南省昆明市盘龙区，用于愈伤组织的诱导及悬浮培养;种子采自云南省弥渡县，用于无菌苗的培养。
1.2 方 法
1.2.1 愈伤组织的诱导及悬浮培养 取生长健壮、无病虫害的植株叶片，消毒后切成约（0.5×0.5）cm的方块，接种到固体培养基（MS + 2， 4-D 2.0 mg·L-1+ BA 0.5 mg·L-1+ 活性炭2 g·L-1）上，25 ℃黑暗培养，诱导形成愈伤组织。继代2次后，选取浅黄色、疏松的愈伤组织1 g，转入50 mL液体培养液（MS+酸水解酪蛋白500 mg·L-1+ 2，4-D 1.0 mg·L-1+TDZ 0.2 mg·L-1）中。25 ℃黑暗条件下，120 r·min-1培养3 d，获得悬浮细胞。
1.2.2 无菌苗培养 选取饱满种子，接种在固体培养基（1/2 N6 + 酸水解酪蛋白1 g·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1 + 活性炭2 g·L-1）上，培养获得离体植株。叶片用于原生质体的分离。
1.2.3 酶解时间筛选 悬浮细胞过60目细胞筛后，800 r·min-1离心5 min，吸除上清液，保留底部细胞层，加入10 mL酶液（纤维素酶1%+果胶酶0.3%+半纤维素酶0.5%）。25 ℃黑暗条件下，60 r·min-1酶解处理2，3，4，5，6 h。
称取生长旺盛的离体植株幼嫩叶片0.7 g，切成1～2 mm宽的细条，放入10 mL酶液（纤维素酶0.5% +果胶酶0.2% + 离析酶0.5%）中。25 ℃黑暗条件下，60 r·min-1酶解处理4，6，8，10，12，14，16 h。
1.2.4 原生质体纯化收集 酶解结束后，70 μm尼龙滤网过筛，收集酶液，500 r·min-1离心5 min，弃上清。沉积于底部的原生质体用13% CPW洗涤液（27.2 mg·L-1 KH2PO4、101.0 mg·L-1 KNO3、1 480.0 mg·L-1 CaCl2、246.0 mg·L-1 MgSO4、0.16 mg·L-1 KI、0.025 mg·L-1 CuSO4、13%（m·V-1）甘露醇，pH值 6.0）悬浮清洗，置换3次（800 r·min-1，5 min）。液体培养液重悬保存。
1.2.5 原生质体的产量测定 采用血球计数板测定原生质体产量，重复3次。统计中央大方格内25个中方格的原生质体数目，根据如下公式计算原生质体密度、原生质体产量：
原生质体的密度（个·mL-1）= 中央大方格内的原生质体数×10×1 000
原生质体产量（个·g-1） =（原生质体密度×悬浮液总体积）/用于分离原生质体的材料鲜质量
1.2.6 原生质体的活力检测 采用二乙酸荧光素（FDA）-酚番红花红双染色法检测原生质体活力，重复3次。取纯化后的原生质体悬浮液20 μL于载玻片上，依次加入2 μL 1%FDA和0.1% 酚番红花红染色液，室温静置孵育2 min，荧光显微镜下蓝光激发镜检，发绿色荧光的原生质体具有活性，呈红色的无活性。随机选取细胞数目大于10的5个视野进行统计。采用如下公式统计原生质体活力：
原生质体活力（%）= 发绿色荧光的原生质体数/原生质体总数×100
1.3 数据分析
采用SPSS 22.0软件进行显著性检验和相关性分析，Origin 2017软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 酶解时间对悬浮细胞原生质体分离的影響
采用纤维素酶1% + 果胶酶0.3% + 半纤维素酶0.5%的酶液处理悬浮细胞2，3，4，5，6 h。结果表明，未经酶解的悬浮细胞单个或多个粘连成团，细胞形状不规则，多呈卵形、月型、椭圆形;酶解2 h，细胞开始分离，形成少量圆形的原生质体;酶解3，4 h，随酶解时间延长，原生质体产量、活力均逐渐增加;酶解5 h，形成少量细胞碎片，原生质体产量和活力达到最高，分别为3.73×105个·g-1、75.84%;酶解6 h，细胞碎片明显增多，产量和活力均逐渐下降（图1）。方差分析表明，不同酶解时间，原生质体产量、活力差异显著（P<0.05）。酶解5 h的原生质体产量、活力均显著高于其它4个酶解时间。相关性分析表明，原生质体的产量与活力存在显著性相关（r = 0.949，P<0.05）。
2.2 酶解时间对幼叶原生质体分离的影响
采用纤维素酶0.5% + 果胶酶0.2% + 离析酶0.5%的酶液处理幼叶4，6，8，10，12，14，16 h。结果表明，酶解4 h，细胞主要呈团状，形成的原生质体数量较少;酶解6，8，10，12 h，随酶解时间延长，原生质体产量逐渐增加，其中酶解12 h，原生质体产量最高，达到1.17×106个·g-1，酶解14，16 h，细胞碎片增加，原生质体产量逐渐下降。同时，酶解4，6，8，10 h，原生质体活力逐步增加，酶解10 h，原生质体活力最高，为80.98%，酶解12，14，16 h，原生质体活力逐渐下降（图2）。方差分析表明，不同酶解时间，原生质体产量、活力差异显著（P<0.05），酶解10 h的原生质体活力极显著地高于其它6个酶解时间。
3 讨论与结论
3.1 原生质体产量及活力变化规律
酶解时间是影响原生质体分离的重要因素。酶解时间短，原生质体不能完全分离，产量较低;酶解时间过长， 细胞易破碎和失活， 原生质体产量、活力也较低[15-18]。本研究也获得相似的结果。采用不同酶解时间处理灯盏花悬浮细胞和幼叶，原生质体的产量及活力差异显著，均呈现先增加后降低的变化趋势，其中悬浮细胞原生质体的产量与活力变化达到显著相关性。
3.2 材料对酶解时间的影响
材料是影响酶解时间的重要因素。幼嫩材料如子叶、幼叶等，适宜酶解时间一般较短，大约为6～10 h[19-22]。愈伤组织可能受继代次数的影响，适宜酶解时间变幅较大。以大豆（Glycine max）继代培养15～20 d 的愈伤组织分离制备原生质体，酶解5 h原生质体产量和活力最高[23]。而苜蓿（Medicago sativa）继代10～12次的愈伤组织，需酶解12 h有活力的原生质体产量才能达到最大值[24]。本研究发现，灯盏花悬浮细胞和幼叶的原生质体产量、活力以及适宜酶解时间存在较大差异。悬浮细胞酶解5 h，原生质体产量、活力达到最高值，而幼叶酶解10 h原生质体活力最高，酶解12 h原生质体产量最高，其原生质体产量和活力普遍高于悬浮细胞。该研究结果可能与两种材料的组织结构及细胞活力差异有关。悬浮细胞为单细胞或小细胞团，能与酶液充分接触，所需酶解时间较短，较长酶解时间，易造成原生质体破碎。同时，悬浮细胞培养过程中可能发生的活力下降情况，影响了原生质体的活力。幼叶只能逐层接触酶液，其适宜的酶解时间较长。由于幼叶取自活体植株，细胞活力较强，分离制备的原生质体活力也可能较高。
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