薛晓芳 赵爱玲 任海燕
摘 要：类黄酮是果树重要的一类次生代谢产物，是重要的生物活性物质之一，具有多种医疗保健功能，它以结合态（黄酮苷）或自由态（黄酮苷元）形式存在于果实、叶片、花等器官中。综述了果树类黄酮的提取技术、分离纯化与含量检测等方面的研究进展，并对果树类黄酮未来的研究方向进行了展望。旨在为果树类黄酮开发利用提供理论参考。
关键词：果树;类黄酮;提取;分离;检测
文章编号：2096-8108（2020）05-0053-05 中图分类号：S665.1 文献标识码：A
Abstract：Flavonoids are an important type of secondary metabolites in fruit trees， which are one of the important bioactive substances and have a variety of medical and healthcare functions. They are present in fruits， leaves， and flowers in the form of binding states or free states. In this paper， the extraction， separation， purification and content identification technology of flavonoids were reviewed. The future research direction of flavonoids in fruit trees was forecasted. The aim was to provide theoretical reference for the development and utilization of flavonoids in fruit trees.
Keywords：fruit trees; flavonoid; extraction; separation; detection
类黄酮（flavonoids），是一类结构中有2-苯基色原酮的特殊化合物[1]，泛指通过中央三碳链与两个芳香环（A环和B环）相互连接而成的多元酚类化合物，即类黄酮都具有C6-C3-C6的基本结构[2-3]。类黄酮在植物中多与糖结合以苷元（结合态）的形式存在，仅有一少部分以自由态形式存在。依据其芳香环的氧化状态不同，可将类黄酮化合物分为黄酮醇（falvonols）、查尔酮（chalcones）、黄酮（favones）、异黄酮（isoflavones）、花色素（anthocyanins）、原花色素（proanthocyanins）、黄烷酮（flavanones）、黄烷醇（flavanols或儿茶素catechins）等[4]。目前为止，已报道的类黄酮化合物多达9 000种[5]。近年来，由于类黄酮化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等医疗保健功能而受到人们的日益关注[6]。类黄酮是果树的一类重要的次生代谢产物，本文综述了果树类黄酮的提取、分离纯化与含量检测方法等方面的相关研究，并对果树类黄酮未来的研究方向进行了展望。旨在为果树类黄酮开发利用提供理论参考。
1 类黄酮的提取方法
类黄酮的提取技术及提取效率直接影响后续的分离纯化与含量检测等研究。目前，类黄酮化合物的提取方法主要有有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、回流辅助提取法和酶解提取法等。
1.1 有机溶剂提取法
类黄酮化合物易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂中，由于甲醇、乙酸乙酯等具有一定的毒性，故多选择乙醇作为类黄酮化合物的提取溶剂。提取不同树种或同一树种不同品种或不同器官类黄酮化合物的最适乙醇浓度有差异。克热木江·吐尔逊江等（2012）[7]研究发现，提取新疆野苹果果实类黄酮化合物的最佳乙醇体积分数为55%。梁鹏举等[8]采用响应面法优化灰枣中黄酮提取工艺的研究表明，当乙醇体积分数为70%时，实际优化的工艺条件与理论预测拟合程度高。山楂总黄酮、柑橘黄烷酮提取的最适乙醇体积分数分别为：70%和60%[9-10]。此外，当乙醇浓度与其他辅助条件如超声时间、提取温度等达到最佳组合时，可提高提取得率。
1.2 超声波辅助提取法
超声波辅助提取具有操作简便、提取效率高等优点。超声波产生的空化效应可加速细胞壁的破裂，有利于快速释放内容物，从而缩短提取时间，提高提取效率，该方法在生物活性物质的提取方面具有广阔的应用前景。马莉等[11]研究了冬枣黄酮的超声波提取方法，得到了超声波提取冬枣黄酮的最佳工艺：料液比125，乙醇体积分数70%，提取时间30 min。Pan等[12]优化了超声波辅助提取山楂黄酮化合物的工艺条件。李萍等[13]采用常温振荡法、液氮冷冻研磨法、匀浆法和超声法等4种方法提取苹果果实中的类黄酮，结果表明，超声法提取时类黄酮提取率高，方法稳定。王楠等[14]比较了超声波辅助提取法、微波辅助提取法和传统溶剂提取法3种方法提取沙枣黄酮的效果，结果表明超声波辅助提取效果最好。笔者对枣果实、叶片、花等不同器官类黄酮提取发现，采用超声波辅助提取会提高类黄酮得率。
1.3 微波辅助提取法
微波辅助提取法能显著缩短提取时间，大大提高黄酮产率。王维力等[15]采用微波-双水相法优化了荔枝皮黄酮提取工艺，发现微波辐射时间为90 s，微波功率为270 W时，荔枝皮黄酮得率为20.74%，与模型计算值20.94%的相对误差仅为0.97%。杨洁等[16]采用微波-離子液体辅助提取枣叶黄酮，结果表明当微波功率为195 W，微波时间为12 min时，黄酮提取率最高为3.20%。施昶等[17]研究了微波提取山楂中黄酮类化合物的工艺，得出微波辐射时间为3.7 min时，山楂叶总黄酮得率最高为8.923%的结论。可看出，不同树种或品种的最佳微波时间差异较大。
1.4 回流輔助提取法
回流提取法由于其操作简单、安全环保、组分提取较完全，因而被广泛应用于果树类黄酮提取中。吴梅青等[18]比较了碱溶液沉法、回流、超声、微波和水提等5种方法对柑橘皮总黄酮提取效果的影响，结果发现，回流提取总黄酮含量大于其他几种方法，其中与超声波辅助提取比较差异不明显，而与其他3种方法差异非常明显。王小双等[19]研究了核桃壳总黄酮提取工艺，结果发现采用超声加回流提取核桃壳总黄酮提取得率为9.13%。超声辅助提和回流辅助提取结合使用，可大大提高提取效率。
1.5 酶解提取法
酶解提取法即通过在提取过程中加入酶发生酶解反应使类黄酮提取效率大大提高的一种提取技术，通常配合有机溶剂进行提取。目前常用的酶有纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶等，其中纤维素酶和果胶酶应用较多。陈建福等[20]研究了纤维素酶辅助提取柚叶总黄酮的工艺，对酶解温度、酶解时间、酶用量和pH值对总黄酮提取率进行了考察，结果表明，各项指标分别为56 ℃、64 min、3%和pH5.5条件下柚叶总黄酮提取率38.62 mg/g与预测值38.79 mg/g的相对误差仅为0.44%。班若男等[21]采用超声波辅助法加纤维素酶法提取冬枣叶片总黄酮，发现纤维素酶用量对黄酮提取率的影响最为显著。
2 类黄酮的分离纯化方法
分离纯化果树类黄酮最常用的方法是大孔树脂法，目前常用的大孔树脂有AB-8、D101、HPD722、HPD400、D301、DM130、HPD-100、HPD-300、NAK-9等，该方法主要以黄酮纯度及树脂纯化过程中的吸附和解吸条件为评价指标。利用大孔树脂对类黄酮化合物的纯化在许多果树上已有报道[22-23]。研究结果表明，AB-8树脂综合性能较好，适于纯化大部分果树类黄酮化合物。另外，采用高速逆流色谱法（HSCCC）[24]、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱[25-26]也可以对类黄酮化合物进行分离纯化。对分离纯化的类黄酮化合物可根据其理化性质及波普数[27]或LC-MS结合核磁共振鉴定其化学结构[28]。
3 类黄酮的检测方法
果树类黄酮含量的检测方法有多种，主要包括分光光度法[29-30]、（超）高效液相色谱法（（U）HPLC）[31-32]、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）[33]、薄层色谱法[34]、毛细管电泳法[35]等。前3种方法应用较多，每种检测技术各有特点。分光光度计法方法简单、使用方便、成本低，但只能粗略测定总类黄酮含量;而色谱法主要用于检测单体组分，例如（U）HPLC法由于其灵敏度高、重复性好而被广泛应用，但该方法成本较高;LC-MS法则可以对已知或未知组分进行定性或定量分析。随着检测技术的不断发展，LC-MS技术已成为代谢组学分析的主流技术[36-37]。代谢组学是检测生物体受扰动或刺激前后或随着植物生长发育进程的大量代谢产物的动态变化，进而阐明生物体代谢相关过程，其研究对象主要是相对分子质量1 000以下的内源性小分子代谢物[38]。果树代谢组学是对果树细胞、组织或器官中所有小分子代谢产物进行定量或定性分析[39-40]，近年来，基于LC-MS方法的代谢组学研究已被广泛应用于果树类黄酮代谢分析中[41-42]，该方法借助庞大的数据库，可检测到的类黄酮化合物种类多，更全面。实际工作中可根据实验目的选择不同的检测方法。
4 几种常见果树的类黄酮含量
果树的叶片、花、果实、种子等不同部位中均含有类黄酮物质，不同发育时期果实类黄酮含量也不同。研究结果表明，叶片、花和种子中的类黄酮含量均高于果实[43-44]，类黄酮含量随着果实发育总体呈下降趋势[45-46]。成熟果实是大多数果树的主要利用部位，对比了12种常见果树成熟期果实总类黄酮含量（表1）。可看出，不同果树的总类黄酮含量差异较大，山楂、核桃青皮、沙棘等的类黄酮含量较高，番石榴、龙眼和杏果实的类黄酮含量较低;果皮和果肉相比，苹果、枣、葡萄、欧李四种果树都是果皮总黄酮含量高于果肉。应加大山楂、欧李、核桃青皮、沙棘等高类黄酮果树的开发利用力度。
5 展望
近年来，随着生活水平的不断提高，对果品营养价值和保健功能的关注度越来越高。类黄酮化合物是果树重要的次生代谢产物之一，不仅赋予果品不同的气味与颜色，更重要的是具有多方面的生物活性与医疗保健功能，成为科研工作者研究的热点内容。目前，果树类黄酮化合物的研究主要是提取技术、分离纯化、检测技术、保健功能等方面，果树类黄酮代谢分子机制方面的研究报道仅涉及苹果[57]、柑橘[58]等大宗果树，对大多数果树类黄酮代谢的分子机理方面的研究还不够深入。建议今后开展以下几方面研究：一是建立统一、标准的果树类黄酮化合物分离纯化与检测体系，为精准鉴定评价奠定基础。二是关注采前、采中、采后果品类黄酮化合物含量变化，为加工确定最适采收期，另外研究加工产品加工前后类黄酮含量变化，使功能性产品真正发挥其应有的功能。三是运用现代分子生物学手段，如基因组学、代谢组学、蛋白质组学或多组学相结合等方法研究果树类黄酮化合物代谢机理及调控机制，为提高果实资源开发利用率和创制高类黄酮含量新种质提供理论参考。
参考文献
[1]李筱玲，邓寒霜.黄酮类化合物提取分离方法研究进展[J].陕西农业科学，2015，61（1）：77-79，92.
[2]高锦明.植物化学[M].北京：科学出版社，2012.
[3]Sun Y J， Tao W Y， Huang H Z， et al. Flavonoids， phenolic acids， cartenoids and antioxidant activity of fresh eating citrus fruits， using the coupled in vitro digestion and human intestinal HepG2 cells model[J]. Food Chemistry，2019， 279：321-327.
[4]Hrazdina G.， Wagner G，J. Metabolic Pathways as enzyme complexes：evidence for the synthesis of phenylpropanoids and flavonoids of membrane associated enzyme complexes[J].Arehives of Biochemistry and Biophysics，1985，237（1）：88-100.
[5]Williams C.A.， Grayer I.U. Anthocyanins and other flavonoids[J]. Natural Product Reports， 2004（21）：539-573.
[6]Brodowska，K.M. Natural flavonoids：classification，potential role， and application of flavonoid analogus.Eur.J.Biol.， 2017，Res7（2）：108-123.
[7]克热木江·吐尔逊江，努尔阿米娜·阿布都肉苏，吐尔逊娜依·迪力夏提，等.新疆野苹果果实中总黄酮的提取工艺[J].食品科学，2012，33（10）：20-23.
[8]梁鹏举，姜建辉，秦少伟，等.响应面法优化灰枣中黄酮提取工艺研究[J].食品工业科技，2016（22）：264-268，273.
[9]王珊珊，苏丽娜，李园园，等.响应面分析法对山楂总黄酮提取条件的优化[J].粮食与油脂，2018，31（8）：83-86.
[10]梁曾恩妮，单 杨.柑橘黄烷酮的提取及新橙皮苷二氢查尔酮制备工艺[J].湖南农业科学，2018（8）：75-77.
[11]马 莉，何宝国，江秀丽，等.冬枣黄酮的超声波提取方法研究[J].青岛大学医学院学报，2014，50（1）：46-48.
[12]Pan G Y， Yu G Y， Zhu C H， et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction （UAE） of flavonoids compounds （FC） from hawthorn seed （HS） [J]. Ultrasonics Sonochemistry， 2012， 19：
486-490.
[13]李 萍，聂继云，李 静，等.4种溶剂法提取苹果类黄酮效果比较[J].中国果树，2010（2）：38-40.
[14]王 楠，刘战霞，程卫东.3种方法提取沙枣黄酮工艺的优化研究[J].安徽农业科学，2018，46（26）：150-155.
[15]王维力，明 李，阮尚全，等.荔枝皮黄酮微波-双水相提取工艺优化及DPPH清除活性[J].食品与机械，2018（11）：
151-155.
[16]杨 洁，关梦玉，吴 霞，等.枣叶黄酮微波-离子液体辅助提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].中国食品添加剂，2018（1）：87-94.
[17]施 昶，黄海飞，李梦园，等.微波提取山楂中黄酮类化合物的工艺优化[J].生物加工过程，2017，15（1）：43-48.
[18]吴梅青，陈 丹，李俊雅.不同提取方法对柑橘皮总黄酮及其抗氧化活性的影响[J].中国林副特产，2017（4）：5-8.
[19]王小双，刘 基，林玉萍，等.核桃壳总黄酮超声提取工艺的优化[J].中国果树，2018（1）：96-99.
[20]陈建福，曾 勤，吴丽敏，等.纤维素酶辅助提取柚叶总黄酮的工艺研究[J].食品研究与开发，2018，39（17）：25-30.
[21]班若男，康兴兴，张圣燕.超声波辅助酶解法提取冬枣叶中总黄酮工艺的研究[J].山东化工，2018，47（17）：42-44，48.
[22]舒祝明，蒋剑平，王建平，等.大孔树脂纯化胡柚皮总黄酮的工艺研究[J].中国现代应用药学，2017，34（5）：49-53.
[23]魏 雨，张景迅，张玉忠，等.银杏黄酮提取工艺及纯化研究[J].化学世界，2018，59（12）：795-800.
[24]吴素玲，张锋伦，张卫明，等.高速逆流色谱法分离制备刺梨黄酮组分[J].食品科学，2009，30（14）：37-40.
[25]姚红娟，唐浩国，郭介之.蘋果黄酮的分离纯化及抗油脂氧化研究[J].食品科学，2014，35（11）：83-88.
[26]马娟娟.山楂叶黄酮的提取、纯化及分离技术研究[D].山东农业大学，2016.
[27]赵功宝.山楂中化学成分鉴定分析[J].广东化工，2015，42（24）：78-79，101.
[28]李喜悦，高 哲，崔 璨，等.枣叶黄酮类成分的分离鉴定及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2015，36（10）：135-138.
[29]杨慧珍，王安柱，慕小倩，等.不同品种桃叶不同生长期总黄酮含量的差异比较[J].西北林学院学报，2014，30（5）：133-136.
[30]周晓凤，郭雪飞，冯一峰，等.不同枣品种果实中功能性成分含量的比较研究[J].食品工业科技，2018，39（12）：296-300.
[31]张元梅，周志钦，孙玉敬，等.高效液相色谱法同时测定柑橘果实中18中类黄酮的含量[J].中国农业科学，2012，45（17）：3558-3565.
[32]郑 洁，赵其阳，张耀海，等.超高效液相色谱法同时测定柑橘中主要酚酸和类黄酮物质[J].中国农业科学，2014，47（23）：4706-4717.
[33]项 亚，赵瑞雪，赖方秾，等.红肉苹果果皮类黄酮组分及抗氧化活性分析[J].植物生理学报，2016，52（9）：1353-1360.
[34]张 瑞，胡娜娜，邢 军.薄层色谱法和硅胶柱层析法分离新疆紫花苜蓿中黄酮类化合物的研究[J].食品科技，2011，36（1）：177-181.
[35]张静姝，余丽丽.流动注射毛细管电泳测定益母草中4种黄酮[J].西北大学学报：自然科学版，2016，46（3）：381-384.
[36]Lu X， Zhao X J， Bai C M， et al. LC-MS-based metabonomics analysis[J]. Journal of Chromatography B.， 2008（866）：64-76.
[37]Gika H G.， Theodoridis G A.， Plumb R S.， et al. Current practice of liquid chromatography-mass spectrometry in metabolomics and metabonomics[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2014（87）：
12-25.
[38]刘 伟，寇国栋.代谢组学研究技术及其应用概述[J].生物学教学，2018，43（9）：2-4.
[39]李泽坤，谢 倩，王 威，等.果树代谢组学研究进展[J].西北植物学报，2014， 34（9）：1909-1915.
[40]许国旺，杨 军.代谢组学及其研究进展[J].中国色谱学报，2003， 21（4）：
316-320.
[41]陈为凯.一年两收栽培模式下葡萄果实靶向代谢组和转录组研究[D].北京：中国农业大学，2018.
[42]Wang F， Chen L，Chen H P， et al.Analysis of Flavonoid Metabolites in Citrus Peels （Citrus retivulata “Dahongpao”） Using UPLC-ESI-MS/MS[J].Molecules，2019， 24， 1-12.
[43]薛晓芳，弓桂花，赵爱玲，等.枣和酸枣不同器官黄酮含量比较及抗氧化能力分析[J].中国果树，2020（1）：59-63.
[44]李利改，席万鹏，张元梅，等.中国特有柑橘属植物基本类型不同组织类黄酮含量分析[J].中国农业科学，2013， 46（22）：
4753-4762.
[45]黄春辉，廖光联，谢 敏，等.不同猕猴桃品种果实发育过程中总酚和类黄酮含量及抗氧化活性的动态变化[J].果树学报，2019，36（2）：174-184.
[46]沈 静，王 敏，苟 茜，等.不同成熟期灵武长枣酚类组分及抗氧化活性差异分析[J].食品科学，2015，36（8）：191-195.
[47]李玉红，赵 维，郭乃妮，等.苹果皮总黄酮的提取及含量测定[J].化学与生物工程，2016，33（5）：68-70.
[48]聂继云，吕德国，李 静，等.分光光度计法测定苹果果实总黄酮含量的条件优化[J].果树学报，2010，27（3）：466-470.
[49]赵旗峰，谭 伟，董志刚，等.‘品丽珠、‘西拉和‘黑比诺3个酿酒葡萄品种不同营养系果实品质比较分析[J].中国农学通报，2018，34（28）：56-60.
[50]Wang P F， Mu X P， Du J J， et al.Flavonoid content and radical scaverging activity in fruits of Chinese dwarf cherry （Cerasus humilis） genotypes[J].J. For. Res， 2018，29（1）：
55-63.
[51]张晓波，邓 捷，温玲蓉，等.不同品种山楂活性成分及其抗氧化活性的研究[J].现代食品科技，2017，33（9）：91-95，292.
[52]耿树香，宁德鲁，陈海云，等.不同品种核桃青皮中主要功能性成分含量测定及分析[J].西部林业科学，2018， 47（5）：
57-63.
[53]邢金香.沙棘不同部位总黄酮含量的比较研究[J].山西林業科技，2018，47（3）：4-5.
[54]高 帆，夏 惠，王 秀，等.不同甜樱桃品种抗氧化物质及抗氧化活性分析[J].浙江农业学报，2017， 29（6）：
926-932.
[55]南 莹，李齐激，马 琳，等.紫外分光光度法测定刺梨总三萜与总黄酮含量[J].遵义医学院学报，2012， 35（6）：
473-476.
[56]胡会刚，杨转英，庞振才，等.番石榴发育期生物活性物质研究[J].热带作物学报，2018， 39（10）：
1940-1946.
[57]黄爱萍，郑少泉.32份龙眼种质资源果肉黄酮含量的鉴定[J].热带作物学报，2013，34（9）：
1663-1666.
[58]夏乐晗，陈玉玲，冯义彬，等.不同品种杏果实发育过程中类黄酮、总酚和三萜酸含量及抗氧化性研究[J].果树学报，2016，33（4）：425-435.
[59]刘龙博，安玉艳，熊丽君，等.5-ALA诱导的黄酮醇积累参与调节苹果叶片气孔开度[J].园艺学报，2016， 43（5）：
817-828.
[60]陈嘉景.柑橘中类黄酮新橘皮糖苷代谢关键基因分离和功能分析[D].武汉：华中农业大学，2017.