[摘要] 目的 探讨载脂蛋白A5基因(APOA5)1131T/C基因多态性与糖尿病肾病患者同型半胱氨酸和脂蛋白a水平的相关性。方法 用聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析(PCRRFLP)技术检测40例健康人及45例糖尿病肾病患者APOA51131T/C基因型,并统计等位基因频率分布情况;用奥林帕斯2700型全自动生化分析仪检测同型半胱氨酸和脂蛋白a水平。结果 糖尿病肾病组APOA51131T/C基因频率、等位基因频率与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病肾病组C等位基因携带者同型半胱氨酸和脂蛋白a水平显著高于非C等位基因携带者(P20 μg/min。其中男23例,女22例。年龄35～76岁,平均(54.7±13.5)岁。
1.1.2 对照组 门诊健康体检者40例,其中男24例,女16例。年龄30～58岁,平均(50.2±12.4)岁。
1.2 主要仪器 奥林帕斯AU2700型全自动生化分析仪、MT PT220型PCR仪、BioRad电泳仪、Bioprofif凝胶图像分析系统。
1.3 方法
1.3.1 生化指标检测 清晨空腹采集静脉血,分离血清后,Hcy、LP(a)采用奥林帕斯2700型全自动生化分析仪检测。
1.3.2 DNA模板的制备 基因组DNA提取采用外周静脉血白细胞改良NaI法,70℃保存。
1.3.3 PCRRFLP法检测APOA51131T/C基因型。
1.3.3.1 引物设计 上游引物5′GGAGCTTGTGAACGTGTGTATGAGT3′,下游引物5′CCCCAGGAACTGGAGCGAAATT3′[1],由北京奥科生物技术公司合成。
1.3.3.2 PCR扩增 反应总体积为25 μl,其中10 X buffer 0.5 μl, MgCl2 1.5μl,dNTP0.5 l,上下游引物各2 l,模板DNA1 l,Taq酶2 l,最后用超纯水补足到25 l。PCR反应条件为: 94℃预变性5 min, 94℃30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸 45 s,共35个循环,末次循环后72℃延伸5 min。将PCR产物用Mse I酶消化过夜,酶切产物经8%聚丙烯酰氨凝胶电泳,溴化乙锭(EB)显色, Bioprofif 凝胶图像分析系统进行摄像分析。
1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0软件进行统计学处理。基因型及不同组间等位基因频率比较采用χ2检验,计量资料比较采用t检验。
2 结果
2.1 糖尿病肾病组与对照组APOA51131T/C基因型及等位基因频率比较 糖尿病肾病组APOA51131T/C基因型及等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义(χ2=0.342,P =0.843;χ2=0.054,P=0.817),结果见表1及图1。
3 讨论
在出现糖尿病微血管并发症前Hcy水平已升高,并随病情加重和微血管并发症的出现更显著,提示Hcy是一种反应性微血管损伤的氨基酸,是糖尿病肾病的重要危险因素[2]。LP(a)可沉积在肾小球,经氧化或糖化修饰后刺激肾脏组织细胞增殖、肥大、细胞外基质堆积,其升高与糖尿病微血管病变有密切关系[3]。有关分析显示,Hcy和LP(a)与尿UAER呈正相关,表明糖尿病患者随着尿UAER的增加,肾病加重,其Hcy和LP(a)增高更加明显,表明Hcy和LP(a)水平与肾脏损害相平行,进一步说明Hcy和LP(a)在DN的发生、发展过程中起一定的作用,血液中异常升高的Hcy和LP(a)可能是DN发生、发展的病理基础之一。
本研究发现,糖尿病肾病患者APOA51131T/C基因型及等位基因频率与对照组无显著性差异,提示:从遗传背景来看,本地区人群糖尿病肾病的发生可能与APOA51131T/C多态性无必然联系,而与本地区人群的生活习惯、饮食结构等因素有关。在健康人群中,APOA51131 C等位基因携带者Hcy、LP(a)较非C等位基因携带者明显升高(P 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文